科创中国

行业领域

生物与新医药技术

需求背景

由于5’端帽子结构和3’ Poly(A)尾结构对mRNA的功能有着重要作用，因此需要评估体外mRNA的加帽效率和3’Poly(A)尾长度和分布。对于mRNA加帽效率检测，当前最常用的是RNaseH介导的切割反应（RNaseH法），但是该方法存在两个问题：第一，由于RNaseH能够在预期切割位点以及邻近位点发生切割，从而产生额外的条带。第二，RNaseH切割反应中存在非特异性的长RNA条带，影响帽子片段纯化。因此RNaseH法会极大影响到加帽效率定量分析的准确性。对于mRNA Poly(A)尾长度和分布检测，常用RNaseT1酶法，即RNaseT1酶在Poly(A)的5’端最邻近的G的3’端产生切割获得Poly(A)片段，但有时候mRNA Poly(A)尾片段会设计成分段式，即连续Poly(A)会被含有G的间隔序列隔开成两段。若此时用RNaseT1酶切割，mRNAPoly(A)尾片段会因为间隔序列中含有G而被RNaseT1酶切割成两段，影响分段式Poly(A)尾的完整检测。因此急需寻求基于质谱检测的样品前处理方法以解决mRNA的加帽效率和3’ Poly(A)尾长度和分布检测准确度问题。

需解决的主要技术难题

寻求基于质谱检测的样品前处理方法以提高mRNA的加帽效率和3’ Poly(A)尾长度和分布的精确检测。具体为：不同脱氧核酶类型的选择，探索酶切位点及DNAzyme序列的设计、酶切时长、酶切反应体系设计，并对其结果进行的验证，实现该产品的应用。

期望实现的主要技术目标

1） 合适的脱氧核酶类型；

2） 基于mRNA的序列设计合适  的DNAzyme；

3） DNAzyme酶切体系建立；

4） 酶切后mRNA加帽片段成分 单一提高加帽效率分析的准确性；                     5）实现分段式Poly(A)尾的完整长度的检测。

需求解析

解析单位：“科创中国”生物医药产业科技服务团（中国微生物学会） 解析时间：2022-11-29

张伟

甲贝医药

CEO

综合评价

本项目的需求非常清晰，即设计合适的脱氧核酶对mRNA的加帽效率和加尾长度和分布的检测，具体从两个方面开展： 1. 脱氧核酶结构的确定。调研文献，选择机理研究清晰的两条高效通用的脱氧核酶。10-23 DRz底物识别部位的特殊序列构成提供了特异性底物结合信息，能把DNAzyme的催化性碱基环固定到RNA底物分子上。10-23 DRz的切割位点位于RNA分子上的未配对的嘌呤和配对的嘧啶之间，在接近生理条件下切割RNA后可产生2'(3')-环磷酸和5'-羟基末端的切割产物。8-17 DRz与10-23 DRz的结构十分相似，所不同的是在8-17 DRz中带有不配对的“wobble”成分，即位于切割点相邻处的rG-dT非配对碱基，8-17 DRz要求的切割位点为AG连接。 （2）主要从酶切位点的设计、酶催化中心两侧的臂长度设计、酶切时长、酶切反应体系等方面对脱氧核酶在mRNA质谱分析中的加帽效率和加尾长度的检测应用进行优化，以期提升催化效率，降低检测成本。在加帽效率实验前，开展了样品处理前后的稳定性测试；在加尾长度的检测前，开展了磁珠用量对检测结果影响的测定等，为测试提供了较为完善的技术支持。

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