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本发明公开了一种稳定表达外源基因的辛德毕斯病毒载体及其制备方法和应用。利用所述的辛德毕斯病毒载体转染细胞成功制备出携带绿色荧光蛋白基因的SINV感染性病毒颗粒。该感染性病毒颗粒经过体外多轮筛选获得适应性突变，在体外可感染多种细胞，感染后可复制增殖，并能提高外源插入基因的稳定性，在鼠脑神经环路可顺向跨多级突触传播，在脑神经环路标记及示踪、非人灵长类神经细胞的标记、药物筛选平台的建立、药物抑制病毒作用机制、病毒疫苗和诊断试剂的研发、动物模型的建立、病毒复制和致病机制的分析等方面具有广泛的应用价值。

1.一种稳定表达外源基因的辛德毕斯病毒载体，其特征在于，所述辛德毕斯病毒载体以pSINV为骨架载体，在所述骨架载体上连接有荧光蛋白基因EGFP和点突变的NSP1基因； 所述辛德毕斯病毒载体上依次连接有UBC启动子的核苷酸序列、5’UTR、NSP1基因的核苷酸序列、NSP2基因的核苷酸序列、NSP3基因的核苷酸序列、NSP4基因的核苷酸序列、C基因的核苷酸序列、E3基因的核苷酸序列、E2基因的核苷酸序列、6K基因的核苷酸序列、E1基因的核苷酸序列、EGFP基因的核苷酸序列、3’UTR；所述UBC启动子的核苷酸序列如SEQ IDNO.5所示；所述5’UTR的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；所述NSP1基因的核苷酸序列如SEQID NO.7所示，所述NSP1基因的第853位核苷酸序列由G突变为A；所述NSP2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；所述NSP3基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；所述NSP4基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；所述C基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示；

在中枢神经系统中拥有非常多不同类型的神经元，它们的树突及轴突共同组成了复杂的神经网络。这些复杂的神经网络，能够使机体进行正常的生理活动，如学习、认知、记忆、恐惧等。神经网络出现异常也会造成相应的神经疾病，如帕金森等。解析大脑神经环路是更加深入了解大脑功能及神经疾病的基础，而病毒示踪工具能够帮助解析大脑神经环路。因此，病毒示踪工具的开发为绘制大脑连接图谱提供了更多的选择。

中国科学院深圳先进技术研究院提升了粤港地区及我国先进制造业和现代服务业的自主创新能力，推动我国自主知识产权新工业的建立，成为国际一流的工业研究院。 深圳先进院目前已初步构建了以科研为主的集科研、教育、产业、资本为一体的微型协同创新生态系统，由九个研究平台，国科大深圳先进技术学院，多个特色产业育成基地、多支产业发展基金、多个具有独立法人资质的新型专业科研机构等组成。开展先进技术研究，促进科技发展。信息、电子、通讯技术研究新材料、新能源技术研究高性能计算、自动化、精密机械研究生物医学与医疗仪器研究相关学历教育、博士后培养与学术交流。

本发明达到了以下技术效果：

1.本发明提供了一种高效、便捷、更加稳定地表达外源蛋白的辛德毕斯病毒系统，无需体外转录和RNA转染细胞的步骤，直接用辛德毕斯病毒感染性载体转染细胞即可，节省时间和操作步骤。该系统制备的病毒相比野生型辛德毕斯载体，突变后的辛德毕斯载体能够更加稳定地表达插入的外源基因，更有助于开展辛德毕斯病毒感染性载体相关的研究。

2.本发明对于开展在体标记神经元、解析神经环路具有重要价值，同时对于其他应用性研究(如蛋白表达、基因治疗、非人灵长类神经细胞的标记、神经环路标记、药物筛选、抗原表位分析、新型疫苗和诊断试剂等)和基础性研究(如复制、包装和致病机制等)具有重要的现实意义和广泛的应用价值。

3.本发明制备的病毒颗粒能够标记鼠脑神经细胞，在96小时可观察到辛德毕斯病毒颗粒在小鼠神经网络中顺向跨突触传播两级神经元。

4.解析神经环路结构是开展脑科学研究的基础，良好的用于神经环路标记的工具对于解析神经环路的结构具有重要意义。SINV能够感染人和鼠等动物的神经细胞，具有作为神经环路标记的潜力。本发明的辛德毕斯病毒颗粒不仅能够用于非灵长类动物，而且还能用于非人灵长类动物的脑科学研究。

技术合作

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。