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本发明检测人CMKLR1、GPR1基因表达量的多重荧光探针定量方法及其应用，属于生物医学技术领域。该方法包括：以人CMKLR1、GPR1基因为检测的目标基因，人GAPDH、ACTB基因为检测的内参基因，分别设计上下游引物和探针；在同一个反应体系中，加入RT‑PCR缓冲液、反转录酶、Taq酶、待测样本总RNA、所有上下游引物和探针混合得反转录反应体系；采用多通道qPCR仪进行反转录及实时荧光定量PCR反应，同时进行荧光信号采集；计算人CMKLR1基因表达量和GPR1基因表达量。本发明检测方法具有样本量小、操作简单、检测用时短、可靠性高的优点。

1.检测人CMKLR1、GPR1基因表达量的多重荧光探针定量方法，其特征在于包括以下步骤： (1)以人CMKLR1基因为检测的目标基因，针对CMKLR1基因部分片段设计上游引物CMKLR1-F、下游引物CMKLR1-R和探针CMKLR1-P； (2)以人GPR1基因为检测的目标基因，针对GPR1基因部分片段设计上游引物GPR1-F、下游引物GPR1-R和探针GPR1-P； (3)以人GAPDH基因为检测的内参基因，针对GAPDH基因部分片段设计上游引物GAPDH-F、下游引物GAPDH-R和探针GAPDH-P； (4)以人ACTB基因为检测的第二个内参基因，针对ACTB基因部分片段设计上游引物ACTB-F、下游引物ACTB-R和探针ACTB-P；

G蛋白偶联受体超家族(GPCRs)在胞外信号向胞内转导过程中起到重要的作用，调控着细胞运动、生长和基因转录这三个癌症生物学中至关重要的因素。过去的十几年中，介导的信号通路已经被证明是原癌基因信号的关键调控者，并且是很好的病症诊断靶点。

Chemerin，又被称为维甲酸受体反应物2(retinoic acid receptorresponderprotein 2)，是一种脂肪因子。Chemerin的主要来源之一是内脏脂肪组织，可调节脂肪细胞的分化和代谢功能，并且它的在循环血中的水平与BMI、肥胖进展和胰岛素抵抗有严密的关联(Robker,Wu,and Yang 2011)。Chemerin通过受体结合发挥其生物学效应，三种受体，截止目前为止：趋化因子样受体1(CMKLR1或ChemR23)、G蛋白偶联受体1(GPR1)和趋化因子(C-C基序)受体样受体2(CCRL2)，可以与chemerin结合发挥生物学功效。De Henau等揭示出chemerin与CMKLR1和GPR1具有相似的亲和力，但与CCRL2的亲和力较低。

中国科学院深圳先进技术研究院提升了粤港地区及我国先进制造业和现代服务业的自主创新能力，推动我国自主知识产权新工业的建立，成为国际一流的工业研究院。 深圳先进院目前已初步构建了以科研为主的集科研、教育、产业、资本为一体的微型协同创新生态系统，由九个研究平台，国科大深圳先进技术学院，多个特色产业育成基地、多支产业发展基金、多个具有独立法人资质的新型专业科研机构等组成。开展先进技术研究，促进科技发展。信息、电子、通讯技术研究新材料、新能源技术研究高性能计算、自动化、精密机械研究生物医学与医疗仪器研究相关学历教育、博士后培养与学术交流。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明可以快速、准确评估细胞中CMKLR1及GPR1基因表达水平，且具有取材量少、操作简便且检测用时少的优点。同时在检测过程中避免额外mRNA逆转录cDNA的步骤，使得逆转录及荧光检测在单管中一步完成，无需打开反应管，避免因开盖及添加其他成分导致的二次污染。整个检测过程只需一个模板，保证反应体系中各基因模板的统一性。荧光信号的产生不仅强烈依赖于靶模板同探针的杂交，而且同时依赖于模板的扩增，所以不存在非特异性扩增的现象。本检测方法中使用两个内参基因对靶基因进行校正，避免由于内参基因表达量的变化导致靶基因表达量计算的不准确性。为了准确地对内参基因进行平均计算，利用几何平均值代替算术平均值，因为几何平均数算法能更好地控制不同基因之间可能存在的离群值和丰度差异。本方法具有以上优点可快速、特异、灵敏地检测CMKLR1及GPR1的表达水平。

技术合作

本发明中探针所涉及的荧光基因和淬灭基团是根据实验室现有qPCR仪检测通道合成的，目前市场上任何荧光、淬灭基团组合均可与探针核苷酸进行修饰合成，为了避免这一问题，故保护任意位置、任意化学基团的修饰。随着技术的发展，可能会用到更短的序列达到检测的目的，故保护体系中引物、探针序列的任意修改。