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本发明检测人GPR1基因表达量的多重荧光探针定量方法及其应用，属于生物医学技术领域。本方法包括：设计GPR1基因的上下游引物和探针；以人GAPDH基因和人18s基因作为检测的双内参基因，设计两组上下游引物和探针；在同一反应体系中，将RT‑PCR缓冲液、反转录酶、Taq酶、待测样本总RNA、和上述上下游引物和探针混合，配置获得反应体系；进行反转录，进行实时荧光定量PCR反应同时进行荧光信号采集；判定GPR1基因在待测样本中是否表达，并计算GPR1的基因表达量。本发明检测方法具有简便快速、特异性高、高通量、无污染等特点，适用于人细胞、组织中的GPR1基因的表达检测。

.一种检测人GPR1基因表达量的多重荧光探针定量方法，其特征在于包括以下步骤： (1)以人GPR1基因为检测的目标基因，针对GPR1基因部分片段设计上游引物GPR1-F、下游引物GPR1-R作为特异性扩增引物，和GPR1-P作为探针； (2)以人GAPDH基因为检测的内参基因，针对GAPDH基因部分片段设计上游引物GAPDH-F、下游引物GAPDH-R作为特异性扩增引物，和GAPDH-P作为探针； (3)以人18s基因为检测的第二个内参基因，针对18s基因部分片段设计上游引物18s-F、下游引物18s-R作为特异性扩增引物，和18s-P作为探针； (4)在同一反应体系中，将RT-PCR缓冲液、反转录酶、Taq酶、待测样本总RNA、上述步骤(1)设计得到的上游引物GPR1-F、下游引物GPR1-R和GPR1-P，上述步骤(2)设计得到的上游引物GAPDH-F、下游引物GAPDH-R和GAPDH-P，上述步骤(3)得到的上游引物18s-F、下游引物18s-R和18s-P混合均匀，配置获得反应体系；

目前针对人GPR1基因的核酸诊断方法尚未建立，而常见的核酸检测方法存在通量较低、操作繁琐、成本高等缺点。鉴于上述问题本发明建立一种检测人GPR1基因表达量的多重荧光探针定量方法。

G蛋白偶联受体超家族(GPCRs)在胞外信号向胞内转导过程中起到重要的作用，调控着细胞运动、生长和基因转录这三个癌症生物学中至关重要的因素。过去的十几年中，介导的信号通路已经被证明是原癌基因信号的关键调控者，并且是很好的病症诊断靶点。

中国科学院深圳先进技术研究院提升了粤港地区及我国先进制造业和现代服务业的自主创新能力，推动我国自主知识产权新工业的建立，成为国际一流的工业研究院。 深圳先进院目前已初步构建了以科研为主的集科研、教育、产业、资本为一体的微型协同创新生态系统，由九个研究平台，国科大深圳先进技术学院，多个特色产业育成基地、多支产业发展基金、多个具有独立法人资质的新型专业科研机构等组成。开展先进技术研究，促进科技发展。信息、电子、通讯技术研究新材料、新能源技术研究高性能计算、自动化、精密机械研究生物医学与医疗仪器研究相关学历教育、博士后培养与学术交流。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明能够快速、准确评估细胞中GPR1基因表达水平，且具有取材量少、操作简便、检测用时少的优点。同时在检测过程中避免额外mRNA逆转录cDNA的步骤，使得逆转录及荧光检测在单管中一步完成，无需打开反应管，避免因开盖及添加其他成分导致的二次污染。整个检测过程只需一个模板，保证反应体系中各基因模板的统一性。荧光信号的产生不仅强烈依赖于靶模板同探针的杂交，而且同时依赖于模板的扩增，所以不存在非特异性扩增的现象。本检测方法中使用两个内参基因对靶基因进行校正，避免由于内参基因表达量的变化导致靶基因表达量计算的不准确性。为了准确地对内参基因进行平均计算，利用几何平均值代替算术平均值，因为几何平均数算法能更好地控制不同基因之间可能存在的离群值和丰度差异。本方法具有以上优点可快速、特异、灵敏地检测GPR1的表达水平。

技术合作

本发明中探针所涉及的荧光基因和淬灭基团是根据实验室现有qPCR仪检测通道合成的，目前市场上任何荧光、淬灭基团组合均可与探针核苷酸进行修饰合成，为了避免这一问题，故保护任意位置、任意化学基团的修饰。随着技术的发展，可能会用到更短的序列达到检测的目的，故保护体系中引物、探针序列的任意修改。