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本发明公开了一种暗荧光蛋白darkmRuby、核酸序列、载体和应用，本发明公开的暗荧光蛋白darkmRuby的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，其激发峰为556nm，为首个550‑570光区的暗荧光蛋白。暗荧光蛋白darkmRuby第94位的甲硫氨酸和第96位的苯丙氨酸对暗荧光蛋白darkmRuby的亮度起关键作用。暗荧光蛋白darkmRuby第174位的苯丙氨酸突变成组氨酸，也能显著增加暗荧光蛋白darkmRuby的亮度。

1.一种暗荧光蛋白darkmRuby，其特征在于，所示暗荧光蛋白darkmRuby的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。 2.编码权利要求1所述暗荧光蛋白darkmRuby的核苷酸序列。 3.一种载体，其特征在于，包含权利要求2所述的核苷酸序列。 4.权利要求1所述暗荧光蛋白darkmRuby的亮度决定氨基酸，其特征在于，所述亮度决定氨基酸为暗荧光蛋白darkmRuby第94位的甲硫氨酸和第96位的苯丙氨酸，和/或为暗荧光蛋白darkmRuby第174位的苯丙氨酸。 5.根据权利要求4所述的亮度决定氨基酸，其特征在于，当所述亮度决定氨基酸为暗荧光蛋白darkmRuby第94位的甲硫氨酸和第96位的苯丙氨酸协同突变成苏氨酸和脯氨酸，和/或暗荧光蛋白darkmRuby第174位的苯丙氨酸突变成组氨酸时，所述暗荧光蛋白darkmRuby的亮度增加。 6.权利要求1所述暗荧光蛋白darkmRuby在制备基于荧光寿命成像的荧光共振能量转移受体或供体中的应用。

本发明所涉及到的技术背景包括以下几个方面：

(1)定点突变技术

定点突变是指通过聚合酶链式反应(PCR)等方法向目的DNA片段(可以是基因组，也可以是质粒)中引入所需变化(通常是表征有利方向的变化)，包括碱基的添加、删除、点突变等。定点突变能迅速、高效的提高DNA所表达的目的蛋白的性状及表征，是基因研究工作中一种非常有用的手段。体外定点突变技术是当前生物、医学各领域研究中的一种重要实验手段，是研究蛋白质结构和功能之间的复杂关系的有力工具。

(2)融合蛋白技术

融合蛋白(fusionprotein)是通过DNA重组技术得到的两个或多个基因重组后的表达产物。是一种为获得大量标准融合蛋白而进行的有目的性的基因融合和蛋白表达方法。利用融合蛋白技术，可构建和表达具有多种功能的新型蛋白。随着人们对蛋白质结构和功能，蛋白质分子间相互作用的认识进一步提高,融合蛋白技术的应用也愈来愈广泛。

中国科学院深圳先进技术研究院提升了粤港地区及我国先进制造业和现代服务业的自主创新能力，推动我国自主知识产权新工业的建立，成为国际一流的工业研究院。 深圳先进院目前已初步构建了以科研为主的集科研、教育、产业、资本为一体的微型协同创新生态系统，由九个研究平台，国科大深圳先进技术学院，多个特色产业育成基地、多支产业发展基金、多个具有独立法人资质的新型专业科研机构等组成。开展先进技术研究，促进科技发展。信息、电子、通讯技术研究新材料、新能源技术研究高性能计算、自动化、精密机械研究生物医学与医疗仪器研究相关学历教育、博士后培养与学术交流。

本发明的有益效果为：

本发明通过荧光蛋白工程，突变筛选出了一种全新的高性能暗荧光蛋白darkmRuby，其光谱性质与其出发蛋白mRuby3相似，且具有相似的高消光系数，同时其量子产率降低到暗荧光蛋白范畴(0.05)。darkmRuby激发峰为556nm，为首个550-570光区(橙红色光区)的暗荧光蛋白。

本发明发现决定darkmRuby亮度的关键开关氨基酸，为darkmRuby第94位的甲硫氨酸(Met，M)和第96位的苯丙氨酸(Phe，F)，将这两个氨基酸协同突变成苏氨酸(Thr，T)和脯氨酸(Tyr，Y)时，可除去暗荧光蛋白特性。

本发明还发现将darkmRuby第174位的苯丙氨酸(Phe，F)突变成组氨酸(His，H)，也能显著增加darkmRuby的亮度。

技术合作

对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。