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基于PMA染色结合荧光定量PCR法快速检测黄瓜棒孢叶斑病菌的方法及应用

成果类型:: 发明专利

发布时间: 2023-10-18 18:13:22

科技成果产业化落地方案
方案提交机构:成果发布人| 王赟 | 2023-10-18 18:13:22

本发明公开了检测或辅助检测多主棒孢菌的方法,所述方法包括以下步骤:A1)、使用叠氮溴化丙锭处理待测样品;。A2)、提取 A1)处理完毕的样品的基因组DNA;A3)、以A2)所得的基因组DNA作为模板,以SEQID No.1所示的单链DNA和SEQ ID No.2所示的单链DNA作为引物进行实时荧光定量PCR,根据扩增曲线确定所述待测样品是否感染多主棒孢菌和/或确定所述待测样品中多主棒孢菌的含量和/或所述待测样品是否为多主棒孢菌。本发明所建立的黄瓜棒孢叶斑病菌PMA-qPCR定量检测方法,具备快速、高效及准确定量的优点,为病害的监测预警提供了技术支撑,对于研究掌握病原菌的侵染源、传播途径和流行规律,制定综合防控技术措施,严防病害入侵具有重要意义。

基于黄瓜棒孢叶斑病菌的琥珀酸脱氢酶b亚基序列设计并合成的一对特异性引物ccf3/ccr3,通过优化pma的质量浓度和曝光时间,确定区分多主棒孢菌死活菌的pma预处理最优反应条件,再以活菌dna为模板进行qpcr的特异性扩增。设置不同比例死活菌混合体系,验证pmaqpcr反应的可靠性。结果表明:当多主棒孢菌浓度为1×107孢子·ml1、pma浓度为80μmol·l1、曝光时间为10min时,能完全抑制死菌的扩增。当活菌比例为0%~100%时,pmaqpcr测得的活菌数与理论活菌数值和菌落计数均在同一个数量级,线性回归方程y=2.5211x+38.834,r2=0.9926,此方法检测灵敏度下限为100个孢子/ml,标准曲线的重复性和稳定性良好。

黄瓜棒孢叶斑病是近年来生产中流行的一种气传病害,易与霜霉病,炭疽病等病害混淆,具有传播迅速,难以防治的特点,严重威胁黄瓜生产.黄瓜棒孢叶斑病又称褐斑病、靶斑病,俗称“小黄点”,多在黄瓜生长中、后期发生,近年来在许多蔬菜产区日趋加重。因该病发病初期病斑表现为多角形,易与黄瓜角斑病和霜霉病混淆,发病后期又与炭疽病有许多相似之处,给正确识别和防治带来了困难。

谢学文,有害生物与环境安全博士,副研究员,2009年至今,中国农业科学院蔬菜花卉研究所工作,主要从事蔬菜主要病害综合防治、土壤微生物群落多样性及生防资源综合利用研究。 围绕园艺作物病害开展相关研究,从病原菌分类、分子鉴定,遗传多样性分析等角度入手,具体开展土传病害生物防治及土壤微生物群落多样性研究,同时开展园艺作物病害防控用药剂的剂型及应用技术研究,致力于解决园艺作物病害综合控制技术难题。该发明团队其他成员为李宝聚、陈利达、柴阿丽、李磊、石延霞、范腾飞。

本发明提供一种地方鸡品种资源保护与利用的育种方法,提高地方鸡品种的产蛋性能和生长速度,实现地方鸡遗传资源的保护和利用的有机融合,有较大的经济效益与社会效益。

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