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本发明公开了工程化免疫细胞、纳米凝胶及其制备方法和应用,该制备方法将PD 1单抗与氧化还原响应的连接剂交联合成纳米凝胶,对其表面进行二苯并环辛炔修饰,接着与叠氮化物标记的T细胞通过点击化学反应相结合,使NG锚点在T细胞表面。PD 1单抗与ACT T细胞的时空共存以及T细胞活化引发的药物释放可以显著增加TME中PD 1单抗的有效剂量。在小鼠皮下实体瘤模型中,锚定在细胞表面的PD 1单抗和T细胞联合抑制了96%的肿瘤生长⊙

本发明提供了一种纳米凝胶的制备方法，其特征是，包括如下步骤：1)、配置连接剂溶液；2)、向单抗溶液中加入步骤1)所述的连接剂溶液进行混合反应，得到纳米凝胶。在一些实施方式中，所述单抗包括PD-1单抗、CTLA-4单抗、TNFα单抗。

本发明涉及工程化免疫细胞、纳米凝胶及其制备方法和应用。

背景技术

从活体组织中分离出的肿瘤浸润T细胞或是基因改造后的患者外周血淋巴细胞能分别通过T细胞受体(TCR)或嵌合抗原受体(CAR)特异性识别肿瘤抗原。在过继细胞疗法(ACT)中，这些肿瘤特异性细胞在体外激活、增殖后被回输至患者体内，对癌细胞进行杀伤。目前，以CAR-T疗法为代表的ACT在某些血液癌症患者中取得了喜人的临床疗效，但其对实体瘤的疗效依旧不尽如人意。其中，免疫抑制的肿瘤微环境(TME)是ACT治疗实体瘤的主要挑战之一。

在TME中，肿瘤细胞利用各种机制如分泌可溶性抑制因子或直接物理接触来抑制T细胞的功能。最有效的方法之一是上调肿瘤细胞自身程序性细胞死亡配体1(PD-L1)的表达。PD-L1与细胞毒性T淋巴细胞(CTL)所表达的程序性细胞死亡受体1(PD-1)结合，从而“劫持”免疫检查点通路，抑制T细胞的抗肿瘤功能。免疫检查点抑制剂可以逆转来自肿瘤细胞的免疫抑制，从而提高外源性ACT细胞和内源性肿瘤特异性CTL的治疗效果。

针对PD-1或PD-L1的单克隆抗体(aPD1和aPDL1)目前正被广泛地运用在临床研究中，以期增强内源性CTL的功能。虽然免疫检查点抑制剂在一部分病人中取得了持久的抗肿瘤效果，但患者对ICI的整体反应率较低，患者的总体生存率仍然不高。对于外源性ACT T细胞而言，尽管免疫检查点抑制剂可以有效延长其功能，但是临床治疗效果一般。此外，大剂量或长时间使用免疫检查点抑制剂可能导致全身性毒副反应，引起胃肠道、内分泌腺、皮肤和肝脏等器官系统的严重不良反应。一些患者甚至在长期用药后对免疫检查点抑制剂产生耐药性或并发自身免疫性疾病。

有研究尝试通过基因工程使CAR-T细胞自分泌免疫检查点抑制剂，或将T细胞PD-1受体的胞内抑制域替换为增殖增强域，来提高CAR-T细胞的治疗效果。然而，CAR-T细胞可能会在患者体内不受控制的增殖，产生安全隐患。

发明内容

在一个方面，本发明提供了一种纳米凝胶的制备方法.

发明人：郑毅然 陈星烨 苏州大学坐落于素有“人间天堂”之称的历史文化名城苏州，是国家“211工程”“2011计划”首批入列高校，是教育部与江苏省人民政府共建“双一流”建设高校、国家国防科技工业局和江苏省人民政府共建高校，是江苏省属重点综合性大学。苏州大学前身是Soochow University（东吴大学，1900年创办），开现代高等教育之先河，融中西文化之菁华，是中国最早以现代大学学科体系举办的大学。在中国高等教育史上，东吴大学是最早开展研究生教育并授予硕士学位、最先开展法学（英美法）专业教育，也是第一家创办学报的大学。1952年中国大陆院系调整，由东吴大学之文理学院、苏南文化教育学院、江南大学之数理系合并组建苏南师范学院，同年更名为江苏师范学院。1982年，学校更复名苏州大学（Soochow University）。

本发明展示了一种通过将免疫检查点抑制剂PD1单抗聚合形成的纳米凝胶(aPD1-NGs)锚定在ACT T细胞表面的方法，使ACT与免疫检查点抑制剂发挥协同作用，从而提高实体瘤治疗效果。我们将PD-1单抗与氧化还原连接剂-3，3′-二硫代双(磺酸琥珀酰亚氨基丙酸酯)(DTSSP)交联形成纳米粒，然后进行表面修饰(图1A)。我们探索了两种方法来增加NG在T细胞表面的载药量。方法一：表面修饰二酰基脂质功的NGs通过二酰基脂质插入细胞膜，锚定到T细胞表面；方法二：首先用带有叠氮官能团的二酰基脂质插入细胞表面，然后将二苯并环辛炔(DBCO)修饰的NGs通过与叠氮的点击化学反应锚定到细胞表面。采用第二种修饰方法，每百万T细胞上负载的PD-1单抗可以多达4μg。静脉注射后，这些载有NGs背包的T细胞在体内循环，并与NGs一起浸润肿瘤。在TME中，过继T细胞被肿瘤抗原激活，上调细胞表面还原电位，导致DTSSP中的二硫键断裂，从NGs释放PD1单抗以对抗免疫抑制(图1B)。在小鼠皮下黑色素瘤肿瘤模型中，aPD1-NG背包可以帮助T细胞显著抑制肿瘤生长。T细胞背包组的平均肿瘤重量仅为由等量游离PD-1单抗辅助T细胞治疗组的18％。本研究阐明了一种协同使用ACT和免疫检查点抑制剂的方法。这项技术可以完善现有的基因改造和材料递送方法，也可以作为一种独立的治疗方法来提高ACT在实体瘤中的治疗效果。此外，这种方法也可以广泛应用于使用天然T细胞、TCR-T细胞或CAR-T细胞的ACT治疗策略。

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