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本发明公开了一种gRNA、质粒与引物设计系统，属于生物信息学领域。本发明结合基于gRNA在线设计软件CHOPCHOP的开源代码、python脚本和Primer3.0，实现根据任意给定的基因组、载体针对靶点基因进行gRNA的设计、质粒及引物的设计，减少了对研究对象的限制，可以有效使用户对更多不同物种进行CRISPRi相关研究；本发明实现对单个或多个靶点基因进行批量的CRISPRi设计并直接输出包含gRNA和载体的完整质粒图谱，方便后续克隆构建时的测序数据比对以及追溯。本发明的系统实现了快速、一站式提供下游湿实验所需要的全部引物和质粒图谱，有效降低科研人员的工作效率，节约时间、经济成本。

一种gRNA、质粒与引物设计系统，其特征在于，包括基因组新增和预处理模块、gRNA设计和评估模块、引物设计模块以及质粒图谱处理模块： (1)所述基因组新增和预处理模块，用于基因组的上传，并给新增的基因组构建index； (2)所述gRNA设计和评估模块，用于对基因组的靶点基因进行gRNA序列的设计、筛选，并分析对影响质粒构建和工作效率的因素； (3)所述引物设计模块，用于设计扩增含有overlap的gRNA的片段所用的引物序列以及扩增线性化载体片段的引物； (4)所述质粒图谱处理模块，用于绘制完整的注释有gRNA、引物信息的质粒图谱。

CRISPR及其衍生技术可广泛应用于基因/基因组编辑及基因表达水平调控等，效率高且方便快捷，如可利用CRISPR实现高效的基因敲除、敲入、替换等，利用CRISPRi可实现基因表达的敲低，可用CRISPRa可实现基因表达的激活，利用CRISPR碱基编辑器可实现基因的定点突变。但是为确保CRISPR及其衍生工具的高效工作，需选择合适的Cas蛋白(识别不同的PAM序列)以适配目标宿主的特定的遗传特征，比如不同类型的Cas蛋白在不同宿主中的工作效率不同，同时高质量的sgRNA可以避免脱靶效应。因此，在构建CRISPR及其衍生质粒，一般需要设计高质量的gRNA，用于构建质粒的引物，绘制目标质粒图谱，质粒图谱可用于查看和分析实验结果，如构建质粒需要通过将目标质粒图谱与测序数据进行比对等。另一方面，近年来，人们试图通过多学科交叉开发可自动化高通量完成合成生物学中设计、构建、测试、学习(DBTL)的各个环节的技术与设备，并将其搭建成大型的“生物铸造厂”(bio-foundry)，实现实验室自动化以及更高水平的重现性，已成为合成生物学发展的长期目标之一。快速高通量完成相关质粒构建设计，对于利用自动化平台开展高通量CRISPR、CRISPRi等相关的研究是十分必要的。

中国科学院深圳先进技术研究院提升了粤港地区及我国先进制造业和现代服务业的自主创新能力，推动我国自主知识产权新工业的建立，成为国际一流的工业研究院。 深圳先进院目前已初步构建了以科研为主的集科研、教育、产业、资本为一体的微型协同创新生态系统，由九个研究平台，国科大深圳先进技术学院，多个特色产业育成基地、多支产业发展基金、多个具有独立法人资质的新型专业科研机构等组成。开展先进技术研究，促进科技发展。信息、电子、通讯技术研究新材料、新能源技术研究高性能计算、自动化、精密机械研究生物医学与医疗仪器研究相关学历教育、博士后培养与学术交流。

本发明开发了一种gRNA、质粒与引物设计系统，结合基于gRNA在线设计软件CHOPCHOP的开源代码、python脚本和Primer3.0，用户通过自行上传基因组文件、线性化载体骨架文件和靶点文件实现根据任意给定的基因组、载体针对靶点基因进行gRNA的设计、质粒及引物的设计，减少了对研究对象的限制，可以有效使用户对更多不同物种进行CRISPRi相关研究；该系统允许用户上传含有table分隔的多个靶点信息的靶点文件以实现对单个或多个靶点基因进行批量的CRISPRi设计，其中，靶点信息包括DNA片段名称、编辑位点名称(locus_tag)、具体的碱基位置；通过CHOPCHOP内置的算法模型对输出的多条gRNA进行质量评估以便用户选择；通过python脚本实现包含gRNA和载体的完整质粒图谱的绘制，方便后续克隆构建时的测序数据比对以及追溯。同时，提供可视化的操作界面，具有在线和离线两种版本方便使用等优势。本发明的系统实现了快速、一站式提供下游湿实验所需要的全部引物和质粒图谱，有效降低科研人员的工作效率，节约时间、经济成本。

技术合作

输出内容主要包括：1)构建目标质粒所需要的引物信息，引物信息存放在Final_result中的Final_CRISPRi_***文件，文件提供了引物对应的靶点名称、在基因组上的位置、设计gRNA的正负链、序列、长度及其GC含量；2)针对靶点的gRNA预测结果，gRNA_result文件提供了针对每个靶点的gRNA预测结果，子文件夹命名为靶点名称_***文件，文件提供了针对靶点预测gRNA的所有靶序列(含有PAM序列)，位置信息(在基因组上的碱基位置、正负链)，及其质量评估(GC含量、序列潜在的自互补性、脱靶效应及综合效率分析)；3)Genbank格式的质粒图谱文件，图谱中注释了gRNA，以及引物信息；4)此外还有原始输入数据input文件、程序执行的参数及输入数据记录配置文件***、程序运行记录文件***。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。