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本发明提供了一种双荧光发射的 荧光染料来简化对病毒RNA的检测方法。该荧光染料与过量肝素钠组成的 检测试剂可以与双链的(脱氧)核糖核苷酸发生特异性结合，产生540nm 左右的荧光峰信号。该540nm的绿色荧光峰的强度与双链(脱氧)核糖核 苷酸的双螺旋结构密切相关，可以用于检测双链(脱氧)核糖核酸的配对 情况，进而检测待测RNA及其突变情况，由此解决现有技术中RNA检测 特异性不高、准确性不高以及检测效率不高的技术问题。

本发明涉及一种具有双荧光发射的荧光探针在检测RNA中的应用，属于分子检测技术领域。该荧光探针与单链(脱氧)核糖核苷酸相互作用时，只会发出640nm左右的红色荧光，当与双螺旋结构的双链(脱氧)核糖核苷酸结合时，会出现一个新的540nm左右的绿色荧光峰。540nm的绿色荧光峰与双链(脱氧)核糖核苷酸的双螺旋结构密切相关，可以用540nm的荧光峰来特异性的检测双链(脱氧)核糖核酸的存在。利用该荧光染料的这一特性，开发了一种快速检测RNA以及RNA碱基突变的新应用，与商业染料SYBR Green I相比具有更宽的检测范围和更好的线性相关性。

影响新型冠状病毒防治的一个主要瓶颈就是对潜在新冠感染病人的诊 断，无论是试剂盒的产能还是诊断所需时间都难以在短时间内满足快速检 测病毒感染、有效隔断病毒传染的需求。确诊病例的核心方法是核酸检测， 但目前核酸检测受制于成本和时间，同时准确率也不高，常出现假阳性和 假阴性结果而贻误病情。因此，提高核酸检测的速度和准确性对增强新型 冠状病毒疫情防治至关重要。同时，对其它非病毒性的RNA检测也亟需开 发新的检测探针。

目前，检测病毒RNA最常用的方法是实时荧光定量聚合酶链式反应 (RT-PCR)，也是这次新型冠状病毒(2019-nCoV)检测的“金标准”。 RT-PCR对病毒RNA的检测主要有两种方法，TaqMan探针法和SYBR Green染料法。TaqMan探针通过空间上的荧光共振能力转移(FRET)而淬 灭目标序列的荧光来特异性检测目标序列，但合成特异性的探针成本较高，且荧光信号淬灭不彻底，本底信号较高；面对紧急情况如此次新型冠状病 毒(2019-nCoV)的突发，需要耗费一定时日进行检测试剂盒的研发和生产， 极大影响疫情控制。SYBRGreen染料法相对简单，其荧光强度随PCR产 物双链DNA的增加而同步增加，检测和运行成本较低。但此种方法特异性 不强，SYBR Green与单链DNA结合也会有一定的背景荧光干扰，易产生 假阳性信号。

华中科技大学（Huazhong University of Science and Technology），简称华中大、华科大 ，位于湖北省武汉市，是中华人民共和国教育部直属的综合性研究型全国重点大学、位列国家“双一流”“985工程”“211工程”、入选“强基计划”“111计划”、卓越工程师教育培养计划、卓越医生教育培养计划、国家大学生创新性实验计划、国家级大学生创新创业训练计划、国家建设高水平大学公派研究生项目、国家级新工科研究与实践项目、基础学科拔尖学生培养计划2.0，是学位授权自主审核单位、全国深化创新创业教育改革示范高校、一流网络安全学院建设示范项目高校、中国政府奖学金来华留学生接收院校、教育部来华留学示范基地，为中欧工程教育平台成员和医学“双一流”建设联盟 、国际应用科技开发协作网 、全球能源互联网大学联盟成员。

能够 取得下列有益效果：

(1)本发明中的荧光探针与聚阴离子，带负电蛋白，以及单链(脱氧) 核糖核苷酸相互作用时，只会发出640nm左右的红色荧光，当与双螺旋结 构的双链(脱氧)核糖核苷酸结合时，会出现一个新的540nm左右的绿色 荧光峰。540nm的绿色荧光峰与双链(脱氧)核糖核苷酸的双螺旋结构密 切相关，可以用540nm的荧光峰来特异性的检测双链(脱氧)核糖核酸的 存在。利用该荧光染料的这一特性，开发了一种快速检测RNA以及RNA 碱基突变的新方法，与商业染料SYBR Green I相比具有更宽的检测范围和 更好的线性相关性。

(2)本发明检测方法不需要将病毒RNA先逆转为DNA再PCR扩增 进行检测，可以更加便捷、快速、准确、特异性地检测待测RNA。

(3)本发明检测方法中荧光探针640nm荧光峰来自于荧光探针与带 负电大分子的静电作用，而540nm的荧光峰来自于荧光探针与双链(脱氧) 核糖核酸的沟槽结合。因此，作者先使荧光探针与过量肝素钠发生完全静 电作用，以此为体系，通过537nm的荧光峰来检测双链(脱氧)核糖核酸 的存在，这一方法可以大大提高对双链(脱氧)核糖核酸的灵敏度的检测。

(4)本发明检测试剂不仅能特异性地检测待测RNA，还可以检测有核 苷酸基突变的RNA。利用探针540nm的绿色荧光峰与双链(脱氧)核糖核 苷酸的双螺旋结构密切相关，可以用540nm的荧光峰强弱来特异性的检测 待测RNA与单链DNA探针的匹配程度，从而特异性识别待测RNA及其突 变情况，该方法具有普适性。

(5)本发明检测试剂在待测RNA浓度为0-1.5μmol的范围内具有很 好的线性关系，远远大于商业染料SYBR Green I的检测范围。同时，相比 于商业染料SYBR Green I，检测试剂在DNA-RNA浓度为0-1.5μmol的检 测范围内，对单碱基错配的DNA-RNA和不配对的DNA-RNA具有更好的 区分度，即可以更好地检测单碱基突变的RNA和非目标RNA。

本专利成果采用技术转让，技术入股，技术合作等成果转化方式，希望进一步实现该专利的有益效果，有兴趣皆可面议。