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本发明公开了一种植物双靶点CRISPR/Cas9载体及其构建方法和应用，首先克隆sgRNA表达框，通过同源重组把sgRNA表达框插入psgR-Cas9-At载体，得到串联两个sgRNA表达框的中间载体；然后通过酶切连接把sgRNA表达框和Cas9表达框插入pBI121载体，得到pBI121-Cas9；随后把sgRNA表达框中的Bpi I酶切位点改造成多克隆位点，得到pBI121-MCS-Cas9；再设计包含两条sgRNA的引物，以串联两个sgRNA表达框的中间载体为模板进行PCR；最后通过同源重组把上一步的产物连入pBI121-MCS-Cas9中。通过上述制备方法可制备得到所述植物双靶点CRISPR/Cas9载体，以pBI121载体为骨架载体，依次连接有sgRNA表达框1、sgRNA表达框2和Cas9表达框。

本发明公开了一种植物双靶点CRISPR/Cas9载体及其构建方法和应用，首先得到串联两个sgRNA表达框的中间载体；然后得到pBI121?MCS?Cas9；再设计包含两条sgRNA的引物，以所述中间载体为模板进行PCR；最后通过同源重组把PCR产物连入pBI121?MCS?Cas9中。通过上述制备方法可制备得到所述植物双靶点CRISPR/Cas9载体，以pBI121载体为骨架载体，依次连接有sgRNA表达框1、sgRNA表达框2和Cas9表达框。本发明的方法提高了双靶点CRISPR/Cas9载体构建的效率，获得所述中间载体和所述pBI121?MCS?Cas9载体后，仅需设计一对引物进行一步PCR和一步同源重组即可成功构建双靶点CRISPR/Cas9载体，方便快捷。另外，本发明一次反应仅需20元，只需合成带接头的一对引物，不需额外的引物及其他试剂，显著降低了成本。

CRISPR/Cas9已经成为目前最常用的基因编辑系统，CRISPR/Cas9包括2部分：Cas9核酸内切酶和sgRNA(single guide RNA)，sgRNA由天然的tracrRNA(transactivatingcrRNA)和crRNA(CRISPR RNA)融合而来。

sgRNA的5’端包括20nt的protospacer序列，该序列和靶向DNA序列互补以实现双链切割；其3’端则为固定的一段具有茎环(stem-loop)结构的支架序列(scaffoldsequence)，该序列和Cas9蛋白带正电的凹槽相互作用形成核糖核蛋白复合物(ribonucleoprotein complex,RNP)。

荆楚理工学院（Jingchu University of Technology）简称“荆楚理工”，位于湖北省荆门市，学院于2007年3月经教育部批准由初创于1956年的沙洋师范高等专科学校和始建于1984年的荆门职业技术学院合并组建而成， [2] 是一所省属公办全日制普通本科高等学校，为湖北省首批地方本科院校转型发展试点学校、“湖北省2011计划”首批牵头高校，“实行“省市（荆门）共建、以省为主”的管理体制。 截至2022年3月，学院占地面积2400余亩，校舍建筑面积35.87余万平方米；设有16个教学学院（部），开设本科专业43个，专科专业15个，涵盖理、工、农、医、文、教、管、艺等8大学科门类；在编教职工1134人，有教授、副教授等高级职称人员342人，博士、硕士678人。享受国务院及湖北省政府特殊津贴的专家4人；有全日制普通在校生19615人，其中本科生13998人。

本发明达到了以下技术效果：

(1)提高了效率：本发明构建了包含2个串联sgRNA表达框的中间载体，设计引物之后可直接一步PCR反应得到“sgRNA1-sgRNA支架-启动子-sgRNA2”片段，不需要经过多轮PCR或者重叠PCR等步骤，有效减少实验步骤；以上PCR产物和线性化的pBI121-MCS-Cas9载体经一步同源重组即可得到最终载体，大大提高了构建双靶点CRISPR/Cas9载体的效率。

(2)降低了成本：现有技术采用Golden Gate克隆(50元/次)、Gibson组装(150元/次)、Gateway克隆(125元/次)、In-Fusion克隆(100元/次)等方法构建双靶点CRISPR/Cas9载体所用的中间载体或者其他试剂都比较贵，本发明的构建方法把sgRNA表达框中的Bpi I酶切位点改造成了多克隆位点(Xho I-Sal I-Hind III)，得到pBI121-MCS-Cas9，Xho I、Sal I和Hind III都比Bpi I酶便宜很多；本发明所用的试剂ClonExpress II One StepCloning Kit一次反应仅需20元。另外，本发明在载体组合构建成功后只需合成带接头的一对引物，不需额外的引物及其他试剂，也节约了不少成本。

本专利成果采用技术转让，技术入股，技术合作等成果转化方式，希望进一步实现该专利的有益效果，有兴趣皆可面议。