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本发明公开了一种基于全基因组结合生物信息学特异性筛选华根霉脂肪酶基因的方法,属于基因工程领域。本发明针对具有特定催化性能和用途的目标脂肪酶,通过全基因组脂肪酶基因挖掘,分类、催化特性预测得到候选基因;将候选基因分别在大肠杆菌中表达,通过分别检测可溶蛋白和包涵体活性进行筛选,获得具有特定催化性能的华根霉脂肪酶基因,并在重组大肠杆菌中进行活性表达制备。最终获得了编码仅在包涵体状态下表现酯合成活性和甲醇解活性的脂肪酶的基因。

可溶性蛋白的获得方法优选将带有目的基因的pET-22b转化*** BL21(DE3)，将阳性转化子单菌落接入含Amp抗性的5ml LB液体培养基的试管中，于37℃200rpm培养3-4个小时作为种子液，1L LB液体培养基中加入3试管种子液，30℃200rpm培养1小时，加入IPTG至终浓度0.4mmol/L进行诱导，16℃180rpm诱导2小时，离心收集菌体，在适当的缓冲液中超声破碎，离心后得到的上清液即为脂肪酶溶液。

脂肪酶又称三酰基甘油水解酶(EC3.1.1.3)，是一种广泛应用的水解酶类，能够在水相中催化水解底物酯键，有些脂肪酶也可以在非水相中催化酯化反应和酯交换反应等。微生物脂肪酶已被广泛应用于很多工业，如油脂工业、制药工业、食品工业和饲料工业等。目前已有数百种微生物脂肪酶报道，并且许多已经商品化，但是，由于脂肪酶种类的广泛多样性，不同脂肪酶的催化特性，如催化活性(酯合成活性、水解活性、甲醇解活性)、底物特异性、位置选择性、立体选择性等有着显著的差异。为满足不同行业对特定特性脂肪酶的需求，进一步挖掘微生物脂肪酶资源，开发和制备特定活性的脂肪酶仍然具有重要的现实意义。本发明从具有特定基因资源的微生物出发，欲采用结合生物信息学和特异性筛选技术，基于微生物全基因组的脂肪酶基因挖掘，分类、催化特性预测的基础上，通过分别检测大肠杆菌外源表达可溶蛋白和包涵体的不同催化特性的筛选技术，获得具有特定特性的新型华根霉脂肪酶基因，并在重组大肠杆菌中进行活性表达制备。本发明在基因工程领域有着广泛的应用前景。

发明人：王栋 徐岩 喻晓蔚

江南大学是教育部直属、国家“211工程”重点建设高校和“双一流”建设高校。学校具有悠久的办学历史、厚重的文化积淀，源起1902年创建的三江师范学堂，历经国立中央大学、南京大学等发展时期；1958年南京工学院食品工业系整建制东迁无锡独立建校，成立无锡轻工业学院；1962年无锡纺织工学院并入无锡轻工业学院；1995年更名为无锡轻工大学；2001年无锡轻工大学、江南学院、无锡教育学院合并组建江南大学；2003年东华大学无锡校区并入江南大学。

(1)本发明针对具有特定催化功能的目标脂肪酶，利用微生物全基因组数据和生物信息学工具进行脂肪酶基因的初步筛选；根据脂肪酶的不同催化功能和用途，分别采用不同的脂肪酶活性分析方法进行进一步筛选具有特定催化功能的脂肪酶。可有效减轻实验工作量，针对性强，筛选效率较高。

(2)通常情况下，有活性的酶包括野生酶及外源表达酶，均为可溶性蛋白；而不溶性蛋白，如大肠杆菌外源表达的包涵体，则不表现酶活。由于脂肪酶可以催化水相、油水界面以及有机相(非水相)介质中的反应，因此，不溶于反应体系中的脂肪酶，例如包涵体，也有可能表现出某些催化能力。本发明根据脂肪酶的催化功能，针对大肠杆菌外源表达时可能出现的不同蛋白形式，包括可溶蛋白和不可溶蛋白(包涵体)，均进行活性筛选分析，有效地提高了获得目的基因及蛋白的可能性。可避免仅仅分析可溶性蛋白活性时，漏掉特定基因编码的酶具有多种不同催化功能的情况。例如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示序列编码的酶，在筛选过程中，如果放弃分析包涵体的不同催化活性，即使基因功能分析预测其具有甲醇解活性，在测不到具体活性的情况下，则还是无法挖掘、确定所述酶的甲醇解活性。而本发明通过对包涵体进行活性分析，最终确定所述酶还具有甲醇解活性，并发现在可溶与不可溶状态下不同催化特性的活力不同。

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