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本发明涉及一种生产莽草酸的重组菌,表达调控细胞不对称分裂的靶点基因和调控莽草酸生产的靶点基因;调控细胞不对称分裂的靶点基因包括编码细胞骨架蛋白PopZ的基因popZ,调控莽草酸生产的靶点基因包括编码DAHP合成酶的基因aroG,编码3 脱氢奎宁酸合酶的基因aroB和编码转酮醇酶的基因tktA。本发明的重组菌实现了从头合成莽草酸,底物为葡萄糖,价格低廉,且该菌株在7.5L发酵罐发酵后,莽草酸最高产量为88.1g/L,得率为0.33g/g,生产强度为1.1g/L/h。

(1)以商业化质粒pTargetF(Addgene Plasmid#62226)为基础，采用全质粒PCR的方式，在rrnB T1终止子后插入T7Te终止子序列，以减少泄露表达；进一步地，采用全质粒PCR的方式，去除sgRNA表达框，获得仅含有Pj23119组成型启动子和双终止的工程质粒pJ01；

(2)以大肠杆菌MG1655基因组为载体，分别扩增获得含有B0034RBS 的aroBopt、aroGfbr、tktA片段，将aroBopt片段采用多片段一步同源重组的方式，插入至PJ01的表达框中，获得PJ01-B质粒，以相同的方法，将aroGfbr、 tktA两个片段采用多片段一步同源重组的方式，插入至PJ01的表达框中，获得PJ01-GAB质粒；

莽草酸是一种良好的医药中间体，通过影响花生四烯酸代谢，抑制血小板聚集，抑制动、静脉血栓及脑血栓形成，并具有抗炎、镇痛作用，还可作为抗病毒、抗血栓、抗脑缺血和抗癌药物。莽草酸还是微生物代谢的重要中间体，是合成生物碱、芳香族氨基酸和吲哚衍生物等的原料，具有极高的应用价值。近年来，莽草酸作为临床上对抗禽流感的唯一有效药物达菲的合成前体而倍受关注。

莽草酸途径广泛存在于植物、细菌等微生物中，利用微生物工程菌合成莽草酸，在生产规模、生产工艺与生产周期等方面具有显著优势，因此成为国内外很多医药公司与实验室研究的热点。莽草酸途径是以磷酸烯醇式丙酮酸、4-磷酸赤藓糖为起始底物，在生物体内经过一系列催化酶的催化作用生成莽草酸，然后再以莽草酸为中间化合物合成一系列芳香族类化合物，如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸等的过程。生物细胞以葡萄糖为初始底物，在经过糖酵解途径合成磷酸烯醇式丙酮酸的同时，通过戊糖磷酸途径合成4-磷酸赤藓糖。生物体内的莽草酸途径以磷酸烯醇式丙酮酸与4-磷酸赤藓糖为起始化合物，在3-脱氧-D-阿拉伯糖-庚酸-7-磷酸(简称DAHP)合成酶的作用下缩合形成3-脱氧-D-阿拉伯糖-庚酸-7-磷酸。DAHP经过3-脱氢奎宁酸(简称 DHQ)合酶的催化作用生成3-脱氢奎宁酸，DHQ在3-脱氢奎宁酸脱水酶的作用下生成3-脱氢莽草酸(简称DHS)。DHS在莽草酸脱氢酶的作用下生成莽草酸(简称SA)。莽草酸经莽草酸激酶催化生成莽草酸-3-磷酸(简称简称S3P)。随后，在一系列酶的催化下，经过分支酸(简称CHA)分别转化为芳香族氨基酸苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸。

目前生产莽草酸的方法主要有控制路径酶的强度表达、调节辅因子的供给、优化底盘菌株和发酵条件优化，如：(i)设计基于群体感应的路径独立的动态调控系统，使细胞生长与莽草酸生产解离，以实现105mg/L莽草酸的有效积累；(ii)调节蛋白酶降解，结合生长期启动子和稳定期启动子，使细胞生长与莽草酸生产解离，产生12.63g/L莽草酸；(iii)利用生长阻滞细胞反应在谷氨酸棒状杆菌中获得最高的莽草酸产量(141g/L)。但是存在含量低、下游分离困难、耗时长、污染大的问题。因此，仍需寻找一种新的生产莽草酸的方法。

本发明在生物工程技术领域有着广泛的应用前景。

发明人：刘立明 丁强 陈修来 高聪 郭亮 胡贵鹏 刘佳

江南大学是教育部直属、国家“211工程”重点建设高校和“双一流”建设高校。学校具有悠久的办学历史、厚重的文化积淀，源起1902年创建的三江师范学堂，历经国立中央大学、南京大学等发展时期；1958年南京工学院食品工业系整建制东迁无锡独立建校，成立无锡轻工业学院；1962年无锡纺织工学院并入无锡轻工业学院；1995年更名为无锡轻工大学；2001年无锡轻工大学、江南学院、无锡教育学院合并组建江南大学；2003年东华大学无锡校区并入江南大学。

为解决上述技术问题，本发明提供了一种调控细胞不对称分裂改善莽草酸生产性能的策略，利用细胞骨架蛋白调控细胞不对称分裂，调节不同的细胞功能，通过引入靶向细胞不对称分裂，解离细胞生长与生产，使得莽草酸积累变多。本发明构建的重组菌表达了调控细胞不对称分裂的靶点基因和调控莽草酸生产的靶点基因，能够实现将微生物法从头合成转化为莽草酸，底物为葡萄糖，价格低廉，莽草酸产量、得率和生产强度分别达到88.1g/L、0.33g/g，和1.1g/L/h。其中莽草酸产量是大肠杆菌生产莽草酸产量中最高，比目前报道过的产量高出5％左右。

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