科创中国

本发明公开了青虾Legumain like基因及其dsRNA的应用,属于生物技术领域。本发明提供了一种青虾Legumain like基因及其dsRNA的应用,包括青虾Legumain like基因、基因片段及其dsRNA和dsRNA在抑制青虾卵巢发育中的应用。首先通过基因克隆获得Legumain like的全序列,其核苷酸序列为SEQ ID NO.1,氨基酸序列为SEQ ID NO.2。以全序列为模板设计RNA干扰引物,获得干扰基因片段SEQ ID NO.3。再由引物合成dsRNA。将dsRNA、dsGFP注射进雌性青虾的围心腔进行干扰,通过检测发现有效地抑制了雌性青虾卵巢的发育。

本发明提供了一种用于抑制青虾卵巢发育的dsRNA，所述dsRNA是以上述青虾Legumain-like干扰基因片段为模板体外转录获得。本发明还提供了所述dsRNA抑制青虾Legumain-like基因mRNA表达的应用。本发明还提供了所述dsRNA抑制青虾卵巢发育或制备抑制青虾卵巢发育的产品中的应用。本发明还提供了一种制备用于抑制青虾卵巢发育的dsRNA的方法，所述方法为，利以核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示的基因片段为模板转录得到dsRNA。本发明还提供了一种生物抑制剂，含有上述用于抑制青虾卵巢发育的dsRNA。本发明还提供了一种抑制青虾卵巢发育的方法，所述方法为将上述dsRNA或上述生物抑制剂注射至青虾围心腔内，该dsRNA或生物抑制剂可沉默/抑制上述Legumain-like基因的表达。在本发明的一种实施方式中，所述dsRNA或生物抑制剂的注射剂量为3.5～4.5μg/g。本发明还提供了一种抑制青虾卵巢发育的试剂盒，含有上述dsRNA或上述生物抑制剂。

青虾，学名日本沼虾(Macrobrachium nipponense)隶属于长臂虾科(Palaemonidae)、沼虾属(Macrobrachium)，体色呈青灰色并有棕色斑纹，由此而得名，又俗称为河虾。自然分布于中国、日本、韩国、朝鲜、老挝、马来西亚、缅甸(缅甸大陆)、越南以及俄罗斯远东地区，逐渐扩散到新加坡、菲律宾、乌兹别克斯坦、伊拉克南部以及摩尔多瓦、哈萨克斯坦、伊朗等地。青虾是我国重要的经济淡水养殖品种，但是一直受“性快熟”问题的困扰。“性快熟”指的是雌虾在繁育季节繁殖多代。这一现象会引起多代同堂，养殖密度过高、饲料消耗量增大、缺氧问题严重等问题出现。所以，解决这一问题对于提高青虾产量，促进青虾产业健康快速发展具有重要意义。

天冬酰胺内肽酶(legumain，LGMN)是半胱氨酸蛋白酶家族的新成员。最早在植物刀豆和豇豆中发现，随后研究人员发现在脊椎动物、哺乳动物中均有legumain的表达。legumain和其他家族的组织蛋白酶一样，主要定位于细胞的溶酶体中，参与降解基质蛋白等多种生理过程。然而关于legumain在机体正常发育过程中和正常组织中的作用研究相对较少。本研究以青虾作为研究对象，研究legumain-like在卵巢成熟发育过程中的作用。

RNAi(RNA interference,RNAi)技术它是指小分子双链RNA可以特异性地降解或抑制同源mRNA表达，从而抑制或关闭特定基因表达的现象。在已发表的研究中有提及到在青虾体内通过干扰卵黄蛋白等基因来抑制卵巢发育，所以此项技术对于解决青虾“性快熟”问题具有重要意义。

本发明在生物技术领域有着广泛的应用前景。

发明人：乔慧 傅洪拓 程丹 张文宜 蒋速飞 熊贻伟 金舒博 龚永生中国水产科学研究院淡水渔业研究中心系农业农村部（原农业部）所属综合性淡水渔业研究机构。前身为“太湖水产增殖科学实验基地”、“亚太地区综合养鱼研究和培训中心”，1978年建立于无锡。因单位撤并及隶属关系，先后有“国家水产总局长江水产研究所”、“中国水产科学研究院长江水产研究所”等多个称谓，1984年改为现称。“八五”以来一直位列“全国农业科研综合实力百强研究所”。2002年11月，被国家科技部、财政部和中编办确定为非营利性科研机构，进入国家科技创新体系。

1、dsRNA1在肝胰腺和卵巢中的沉默效率达到88.51％～99.41％，有效的抑制了青虾Legumain-like基因的表达。

2、注射dsRNA1可以有效降低青虾Legumain-like基因mRNA的表达，青虾在17天的性腺指数较对照组降低了50％，抑制了青虾卵巢发育速度。

科技成果只有通过实施开发应用，使其转化为生产力，才能取得经济效益和社会效益。成果方目标是将科技成果转化为现实生产力，期待有意愿的企业或合作单位进行合作推广或者进行产品生产。考虑合作转化、许可+合作等转化方式与企业、科学技术研究开发机构和其他组织建立合作关系。