科创中国

生物与新医药技术,生物产业

即时检测（POCT）是利用便携式设备在采样现场快速完成检测的技术，具有成本低、操作简便、检测快速等优点，在临床检验、食品安全分析、现场执法检测等领域具有巨大需求。近几十年，POCT产业得到快速发展。我国的POCT市场近年来年增长率保持在20%-30%，远超全球POCT市场的增长速度，未来POCT产业将具有广阔的市场前景。但迄今为止，商品化的即时检测生物传感器种类有限，主要市场份额都被国外企业占据。中国POCT 研发起步晚，研发投入不足，毫无竞争优势，如需发展新型 即时检测技术和器件。气压测定简单可快速，操作简便，且便携式气压计价廉。因此，气压型即时检测法有望发展为普适性的新型即时检测技术。气压型即时检测法的灵敏度和分析速度都取决于催化剂的性能和产气反应的效率。相比天然酶；纳米酶具有催化活性稳定、功能可调、可规模化制备及价格较低的特点，有利用发展价廉的即时检测法。因此，本项目拟制备新型纳米酶，研究底物价廉、稳定、绿色高效的新型产气反应，构建基于纳米酶的气压型即时检测新方法。这对于纳米酶生物传感与分析和即时检测技术的发展具有重要意义

1、将氨基化的磁珠与醛基化的端粒酶引物反应，制备磁珠/端粒酶引物复合物。 2、将铂纳米颗粒与巯基化的cDNA探针反应，制备铂/cDNA复合物。 3、将待测细胞进行裂解提取端粒酶，以提取的端粒酶RNA为模板，对磁珠/端粒酶 引物复合物进行扩增。 4、将步骤3的扩增产物和磁珠/端粒酶引物复合物分别与铂/cDNA复合物进行杂交。 5、在常温、密闭条件下，将步骤4的两个杂交产物分别与双氧水进行反应，反应完后，分别检测两个反应体系的气压，若步骤3的扩增产物对应体系的气压大于磁珠/端粒酶引物复合物对应体系的气压，说明待测细胞有活性端粒酶，否则，待测细胞无活性端粒酶。

本发明基于铂纳米颗粒对过氧化氢的催化作用，构建了一种即时检测端粒酶活性的方法。当存在活性端粒酶时，磁珠表面修饰的端粒酶引物会与端粒酶结合，使得端粒酶引物沿着其3’末端被延长，形成一条带有TTAGGG重复序列的DNA单链，这条长的DNA单链能够与许多cDNA杂交。本发明将cDNA的5’端修饰到铂纳米颗粒表面，这样就使得铂纳米颗粒固定到了磁珠的表面，通过磁性分离之后，多余的铂纳米颗粒被去除。在加入过氧化氢时，利 用铂纳米颗粒的催化作用，过氧化氢分解产生氧气，体系气压发生变化，再采用便携式气压计检测体系的气压值，活性端粒酶的存在会使气压变化值较大，基于此即可实现对端粒酶活性的即时检测。本发明检测方法简单、快速、灵敏，可以检测不同种类肿瘤细胞中端粒酶 活性的表达水平，在以端粒酶为靶点的癌症的治疗诊断方面具有重要的意义。