本发明公开了一种定向催化合成尿苷磷酰化合物的方法,以尿苷或乳清酸和磷酸根离子为底物,以葡萄糖作为核糖基团供体和能量供体,利用有透性的微生物细胞为酶源,通过阶段性改变反应温度和溶氧量为手段,促使反应体系定向生物催化合成尿苷磷酰化合物。本发明可以根据需求生产三种物质的任意之一种,反应体系简单,无毒,生产成本低廉,控制手段简单易行,极大方便了工业化中的生产控制。以尿苷做底物时UMP、UTP和UDPG的得率分别可达到77%、67%、61%;以乳清酸做底物时UMP、UTP和UDPG的得率分别可达到70%,61%和53%。