科创中国

技术领域

本发明涉及生物医疗技术领域，尤其涉及一种基于COPB2与NUPR1的前列腺癌预测系统。

背景技术

根据美国癌症协会2018年预测数据，前列腺癌（prostate cancer，PCA）仍是男性最常见的恶性肿瘤，其死亡率仅次于肺癌。我国2015年新发现前列腺癌患者***万人，新增死亡人数为***万人。依据2017年2月国家癌症中心最新数据显示，前列腺癌发病率随着城市化发展程度逐渐上升，大城市前列腺癌发病率为***万（居大城市男性癌症发病率第五位），中等城市***万，小城市<5/10万，大城市发病率几乎是小城市的4倍，前列腺癌已成为威胁我国男性健康的重大疾病。

在前列腺癌发生的早期，雄激素受体（Androgen receptor, AR）通路发挥关键作用，雄激素阻断治疗对80%以上的患者有效，但经过中位时间14-30个月后，几乎所有患者都将逐渐发展为雄激素非依赖状态，即去势抵抗性前列腺癌（Castration refractory prostate cancer, CRPC），这是晚期前列腺癌患者死亡的主要原因，中位生存时间小于20个月。CRPC发生机制相当复杂，目前研究表明除AR通路发挥重要作用外，肿瘤相关通路PI3K/Akt，Ras/MAPK，TGF-β等均参与CRPC的进程。尽管多西紫杉醇/强的松和AR阻断药（如阿比特龙、蒽杂鲁胺）能延缓CRPC进展，但临床效果有限，因此深入研究疾病发展机理，探索新靶标及开发有效的治疗方案依然是目前研究的热点和难点。

COPI是由7个亚基构成的七聚体复合物【亚基：ε-、α-、β’-（COPB2）、β-、 γ-、δ-、ζ-】,目前研究发现，膜泡转运系统的正常运行是细胞发挥功能的基础，膜泡转运相关的调节蛋白在癌症发生发展中发挥重要作用。NUPR1属于高活动性，分泌型多肽类转录调节因子，在细胞应激反应中发挥重要作用并参与肿瘤的转移过程。因此我们提出了一种基于COPB2与NUPR1的前列腺癌预测系统。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺点，而提出的一种基于COPB2与NUPR1的前列腺癌预测系统。

为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

一种基于COPB2与NUPR1的前列腺癌预测系统，包括以下步骤：

S1、研究COPB2、NUPR1单个或者组合的表达量与临床PCA的关系，以及与CRPC患者进展及预后相关性；

S2、探索COPB2与NUPR1在前列腺癌中互相调控的关系，并探索对肿瘤增殖和侵袭的影响及其关键机制，所述S2具体的包括以下步骤：

A1、Affymetrix全基因表达谱芯片的制作及IPA分析；

A2、研究COPB2与NUPR1在前列腺癌中相互调控并对肿瘤增殖和侵袭的影响；

A3、免疫共沉淀Co-IP实验检测COPB2与NUPR1相互结合；

A4、检测COPB2与NUPR1定位变化；

A5、寻找COPB2与NUPR1互相调控下游关键信号。

优选的，所述S1中：

先收集200例前列腺癌组织标本，病理诊断200例癌及癌旁组织；

免疫组化半定量测定组织中COPB2和NUPR1的表达；

设定染色阳性率评分标准：0%为0分；1-25%为1分；26-50%为2分；51-75%为3分；76-100%为4分，染色程度区分标准：无为0分；低为1分；中为2分；高为3分；

单倍型积分值（IHS）= 染色阳性率 × 染色程度，高于 6分为高表达，低于 6 分为低表达；

将检测结果进行分组：COPB2低表达、COPB2高表达、NUPR1低表达、NUPR1高表达、COPB2高表达+NUPR1低表达、COPB2高表达+NUPR1高表达、COPB2低表达+NUPR1低表达、COPB2低表达+NUPR1高表达；

收集上述 200 例患者初诊PSA 值、病理、预后资料，利用 SPSS、Fisher及卡方检验分析分类变量与COPB2和NUPR1表达量的关系，利用Cox回归模型预测复发及进展因素，最后采用Kaplan-Meier 分析绘制复发及无病生存曲线。

优选的，所述A1中具体操作步骤为：

准备COPB2干扰组和阴性对照组，每组3个复孔，提取总RNA，RNA质检，芯片杂交、洗染和扫描，最后完成芯片上机分析；

制作火山图、散点图、聚类图、疾病与功能分析、经典通路分析，并采用Ingenuity Pathway Analysis软件分析预测COPB2干扰后关键基因的改变，通过Z-score值，激活预测蛋白NUPR1作为研究的对象，利用生物信息学及IPA软件制作NUPR1的调控网络图。

优选的，所述A2中包括以下部分：

病毒感染细胞、

增殖、侵袭功能学实验、

裸鼠皮下成瘤实验。

所述病毒感染细胞具体步骤为：

实验设siCOPB2+siNUPR1、OE-COPB2+siNUPR1、siCOPB2、OE-COPB2、对照COPB2和对照NUPR1共6组，病毒感染PC-3/DU-145/CWR22RV1/LNCaP 细胞，预实验确定最佳 MOI、感染条件及感染效率，正式实验为感染3天后观察感染效率，每组细胞分为两份，一份提取细胞总 RNA，一份提取总蛋白，RNA→cDNA→qRT-PCR检测 3 组中COPB2mRNA定量表达；根据 Western Blot 法步骤检测 3 组中COPB2蛋白的表达。

优选的，所述增殖、侵袭功能学实验包括以下内容：

CCK8法检测细胞生长、

流式细胞周期、

流式细胞凋亡、

克隆形成检测细胞增殖能力、

划痕愈合实验检测细胞迁移能力、

检测细胞侵袭能力。

优选的，所述裸鼠皮下成瘤实验具体步骤为：

实验设siCOPB2+siNUPR1、OE-COPB2+siNUPR1、siCOPB2、OE-COPB2、对照COPB2和对照NUPR1共6组，收集密度为 5×106 病毒感染对数期细胞 PC-3/DU-145，与5 mg/mL 的基底膜基质混匀制成1 mL细胞悬液，在裸鼠右侧腋下注射*** mL细胞悬液，含1×106 细胞数；

每5天观察记录肿瘤形成、生长情况，游标卡尺记录肿瘤长径和短径，按公式***×长径×短径 2计算肿瘤体积；

接种42天后颈髓离断法处死裸鼠，完整剥出瘤体，称重，根据测量肿瘤体积，绘制肿瘤生长曲线；

组织一部分Western Blot 法检测COPB2和NUPR1表达情况，另一部分制作石蜡切片，IHC 检测COPB2和NUPR1的表达；

IHC和 Western blot检测移植瘤组织CD31和VEGFA表达，肿瘤微血管密度计数。

优选的，所述A3中具体步骤为：

准备PC-3/DU-145细胞，细胞或组织裂解液加入适量的COPB2一抗，将抗体耦联到protein A sepharose上，根据表达蛋白的量，加入不等量的细胞裂解液，加1-5μg的抗体和10μL的Protein A，Protein A为50%质量分数的悬液，用细胞裂解液补充至总体积到1mL于4 ℃孵育4h；Beads通过离心沉淀下来，然后用1×HNTG buffer洗3次，每次500 μL；沉淀用 30μL 1×laemmLi loading 缓冲液洗脱上样，100℃加热10 min进行SDS-PAGE 电泳以及免疫印迹，检测COPB2与NUPR1结合情况。

优选的，A4中具体步骤为：

实验设siCOPB2+siNUPR1、OE-COPB2+siNUPR1、siCOPB2、OE-COPB、对照COPB2和对照NUPR1共6组，生长在12 mm玻片上的细胞用冰浴的 1×PBS（pH ***）洗3遍，然后用–20℃甲醇固定3-5 min，细胞再用***%的 Triton X-100通透5-10 min，被通透后的细胞用PBS洗3遍后，用含50mM(NH4)2SO4 的1×PBS（pH ***）室温孵育5min以消除醛基，再用1×PBS（pH ***）洗三遍，被固定后的细胞在室温用含1%BSA的TBST（pH为***）封闭1 h，一抗稀释在TBST-BSA中，一抗稀释比例为：1:100-1:1000，在 37℃孵育2 h，然后用TBST-BSA洗5次，每次10min。二抗稀释比例为：1:500-1:1000，于暗处室温孵育1 h，玻片用PERMAFLUOR aqueous mounting medium封闭并在室温风干，然后用激光共聚焦显微镜分析拍摄图像检测COPB2与NUPR1定位的变化。

将样品分为前列腺癌/癌旁；CRPC/激素依赖前列腺癌两组，冰冻切片在室温晾干，置于冰丙酮中固定5 min，随后在PBS中洗两遍，以10%羊血清封闭1 h，倾去封闭液，滴加适当比例稀释的一抗，室温孵育1-2 h，PBS 清洗，5 min×3次，再滴加FITC耦联的羊抗兔的IgG和罗丹明标记的phalloidin，于暗处室温孵育1 h，再用PBS清洗后，以DAPI 染色1 min，玻片用PERMAFLUOR aqueous mounting medium封闭并在室温风干，荧光图片在激光共聚焦显微镜上拍摄，检测COPB2与NUPR1定位的变化。

优选的，所述A5中：

先分组：PC-3细胞的COPB2干扰/对照和COPB2过表达/对照，通过Affymetrix全基因表达谱芯片结合质谱，后续 IPA 生信分析方法，筛选下游CRPC肿瘤相关关键信号通路；

Western blot 对上述关键信号蛋白进行鉴定，确定关键信号；

采用信号通路抑制剂，设对照组，通过CCK8、克隆形成和Transwell侵袭实验观察细胞增殖和侵袭的前后变化。

本发明的有益效果是：

通过本系统可对前列腺癌分子的各个阶段的生长机理进行研究，另一方面可明确COPB2与NUPR1蛋白互相调控的关系和具体机制。

利用本发明系统进行前列腺癌分子分型预测，能更好的判断前列腺癌生物学行为，本发明的直接目的不是得到诊断结果，而是为制定个性化治疗方案提供参考依据。