科创中国

其他

SAVINASE是一种碱性蛋白酶，常作为洗衣液的酶添加剂，能有效去除纺织品上的蛋白质污渍，SAVINASE已成功应用于多个洗衣液品牌中。随着SAVINASE的专利已经到期，如何以低廉的成本发酵获取高产的SAVINASE，将是该领域竞争的关键点。本项目在枯草芽孢杆菌中，通过构建芽孢杆菌信号肽文库，筛选新的信号肽，优化该酶的分泌条件，获得了低廉成本的高附加值产品SAVINASE。 本项目总体技术方案如下：（1）以枯草芽孢杆菌与地衣枯草芽孢杆菌基因组DNA作为模板，通过特异性引物扩增Sec途径相关的信号肽DNA文库。构建文库后，将文库DNA与SAVINASE基因propeptide与mature peptide相连，以大肠杆菌枯草芽孢杆菌穿梭载体pNW33N作为骨架，经过克隆转化，构建重组质粒，保存于大肠杆菌细胞内。在此基础上，提取重组质粒，转化进入枯草芽孢杆菌蛋白酶缺陷菌株WB800中构建细胞信号肽文库，并且通过已经构建的高效筛选平台筛选分泌效果优于原信号肽的新信号肽类别。（2）经过测序确定新信号肽序列后，本项目将结合随机突变与理性突变定向进化新信号肽，期望获得分泌效果更加优良的突变信号肽。（3）在获得突变信号肽后，将其与SAVINASE基因propeptide与mature peptide相连，通过枯草芽孢杆菌整合载体，整合至染色体中，进行高效分泌表达。 在创新性方面，本项目通过信号肽的优化，在不降低原酶学性质的基础上，实现该酶以低廉成本进行的大量生产；其次，本项目筛选的信号肽适用于该酶的突变酶，应用面较为广泛；最后，本项目所建立的快速筛选平台以及信号肽库，亦可对其他大宗酶类，如淀粉酶与脂肪酶，实现分泌优化，项目具有良好的可持续性。 本项目主要成果有：（1）筛选得到优化SAVINASE分泌的信号肽，使SAVINASE的分泌水平较野生型信号肽提高***倍；（2）得到优化信号肽阳性突变体序列，使蛋白酶的分泌活性较突变前提高16%；（3）开发出信号肽文库试剂盒，可用于优化各种蛋白在枯草芽孢杆菌中的分泌水平；（4）开发出温敏整合载体，可将各种外源基因整合入枯草芽孢杆菌染色体中。 项目开发了四种产品，其中信号肽文库产品和温敏整合载体以及芽孢杆菌感受态细胞产品已经投入生产、销售并产生了经济效益，第四种产品SAVINASE（蛋白酶）的生产尚处于初始阶段，预计未来将有巨大市场潜力。