科创中国

其他

(一)课题来源与背景 miRNA在临床上发现与许多疾病相关。对miRNA的基因敲除是研究其功能的最佳办法，但传统的构建基因敲除小鼠费时费力。而目前常用的RNAi技术只能达到抑制基因表达。因此细胞水平的基因敲除是人们迫切的需要。2014年Nature报道在CRISPRCas9靶向基因敲出库的基础上，结合高通量测序技术可应用于抗性基因的筛选。因此CRISPRCas9技术的miRNA基因敲出库具有广泛的市场需求和应用前景。(二)技术原理及性能指标1.围绕生物医学研究领域miRNA的研究应用需求，采用最新的基因靶向敲除技术（CRISPRCas9）开发可以在细胞水平实现基因敲除的病毒载体库。该库适合后期的高通量测序筛选。2.对miRNA基因敲除库的筛选应用，提供一个高通量测序筛选的研究应用范例。为后期产品推广提供坚实的说服力。【主要内容】1.构建基于慢病毒骨架的CRISPRCas9载体，检验该载体的病毒包装和转染的效率。并提供优化方案以达到满足后期建库的要求。2.优化CRISPRCas9的剪切效率及解决脱靶问题：1）用两种以上设计软件优化设计针对miRNA基因组序列的sgRNA剪切靶点。2）有文章报道18个ntsgDNA长度具最佳剪切效率。本项目选实验结果最好的最优长度为后续实验方案。3）对于脱靶问题，另一个方案是利用“Double Nick”方案，即“双靶点+nickaseCas9切口酶”，nickaseCas9切口酶并不直接剪断基因组，只能对基因组剪开一个切口，这样只有双靶点识别符合的情况下才能剪断目标片段，从而可以极大的降低因非完全配对造成的脱靶效应。3.批量构建上述验证好载体基础上的，基于CRISPRCas9靶向技术的miRNA基因敲出库。库中序列以miRBase20版为准。4.临床应用检验：使用上述病毒库载体，包装病毒并感染前列腺癌细胞株，感染的细胞在去雄激素的条件下培养，获得对雄激素不敏感的细胞株。提取DNA，以病毒骨架上的通用序列来设计引物并扩增；PCR产物送公司测序；分析获得参与雄激素不敏感突变机制中的miRNA分子。为进一步的前列腺癌临床去势治疗失败提供了新的研究靶标。【拟关键技术问题】1）Cas9酶序列较长，可能影响病毒的包装效率问题我们将采用双病毒包装可最大限度地避免cas9酶未成功包装的问题，提高病毒的包装效率2）CRISPRCas9的脱靶和剪切效率问题CRISPR/Cas9存在一定的脱靶效应。本项目将从生物信息学优化靶序列预测、采用双靶点突变等方法降低其脱靶的概率（三）技术的创造性与先进性1）应用创新：（1）可以实现细胞株水平的基因敲除（2）结合第二代测序技术，实现高通量的基因功能筛选2）技术创新：（1）采用双病毒方案，解决Cas9酶较大的问题（2）采用双靶点nick敲除等方法降低脱靶的概率（四）技术的成熟程度，适用范围和安全性1）成熟程度（1）我们对miR205敲除载体进行病毒包装效率鉴定，证明感染率为92%。大于技术指标90%的要求。（2）我们对miR205敲除载体病毒感染293T和LNCap细胞株，T7E1实验证明对应 miRNA基因组剪切效率达 87%以上。大于技术指标80%的要求。（3）华大基因质检通过合成的Oligo Pool：我们针对1874个miRNA基因，共设计了7306个靶序列，和200个对照靶序列。委托华大基因公司采用芯片方式合成和文库方式构建Cas9克隆库。远大于miRNA基因敲出库包括不少于500个以上的 miRNA基因的要求。（4) 捷瑞公司测序证明送检的miRNA基因敲出库序列正确。2）适用范围本技术适用于生物技术领域一般性研究。安全性不存在安全性问题（五）应用情况及存在的问题本技术目前应用情况良好，尚无重大技术缺陷问题。