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免疫治疗是晚期实体瘤治疗的重要手段之一。经过几十年的长足发展，历经了肿瘤细胞因子治疗（包含白介素、干扰素及一些多肽类的衍生物等）、肿瘤疫苗治疗、细胞免疫治疗以及免疫检查点治疗几个阶段。近年来，肿瘤免疫治疗取得了重大进展，《科学》杂志将肿瘤免疫治疗列为“2013年十大科学突破”首位，尤其以PD-1/PD-L1负性检查点为代表的单克隆抗体，在晚期实体瘤治疗中取得巨大成功。截至目前为止，已有Pembrolizumab（PD-1单抗，默沙东）和Nivolumab（PD-1单抗，施贵宝）获FDA批准用于治疗恶性黑色素瘤、非小细胞肺癌、肾癌及头颈部肿瘤，以及Atezolizumab（PD-L1单抗，罗氏）获批用于治疗泌尿系上皮肿瘤。同时，在全球范围内，还有数千个免疫治疗相关的临床研究正如火如荼地开展。免疫治疗正改变着恶性肿瘤的治疗策略。但不可否认的是，单药PD-1/PD-L1单抗治疗的有效率仍然较低。例如，针对非选择性人群，单药PD-1单抗在晚期非小细胞肺癌的客观有效率为19-22%，在晚期恶性黑色素瘤中为25-35%，在晚期肾癌患者中约为25%，而在晚期头颈部鳞癌及肝癌中则分别为14%、15%左右。因此，如何进一步筛选优势人群，或针对特定人群优化免疫联合策略，是在精准医学时代背景下亟需回答的问题，也是现阶段免疫治疗研究的一大热点。

目前，FDA已批准两个免疫治疗相关靶标用于优势人群筛选：一是PD-L1表达丰度，是利用免疫组化技术，对微环境中肿瘤细胞及浸润性免疫细胞的PD-L1表达水平进行检测，主要应用于晚期非小细胞肺癌及胃癌的PD-1单抗靶标预测；另一个是错配修复蛋白及微卫星不稳定（Mismatch repair/microsatellite instability，MMR/MSI）的检测。2017年默沙东全球多中心单臂临床研究数据显示，在149例MSI-H/dMMR的泛瘤种患者中，Pembrolizumab的客观有效率达39.6%。基于该数据，FDA批准Pembrolizumab用于晚期实体瘤合并MSI-H/dMMR的患者的二线治疗。然而，在临床实际应用当中，这两个靶标仍然存在诸多瓶颈。首先，dMMR在多数晚期实体瘤中发生率较低，例如，在晚期结直肠癌中发生率为5-8%，晚期胃癌中为3-5%，而晚期肺癌中仅不到2%，这导致了该靶标获益人群的局限；另外，有研究结果显示，即使在PD-L1强阳性（超过50%肿瘤细胞阳性）的晚期非小细胞肺癌患者中，PD-1单抗（作为一线治疗）的客观有效率为44.2%；在PD-L1阳性（超过1%肿瘤细胞阳性）的晚期胃癌三线治疗中，有效率仅为22.2%。也就是说，即使经过PD-L1的阳性选择，PD-1单抗仍对一大部分患者无效。因此，想要突破上述瓶颈，进一步细化免疫分型、深入研究耐药机制则是当下至关紧要的任务。

1、细化微环境的免疫分型。大量循证医学证据证实，切实有效的分子分型是指导精准治疗的基础。肿瘤微环境涉及要素众多、关系复杂，肿瘤细胞得以摆脱免疫系统的监控识别、逃离T细胞的杀伤，离不开诸多要素的共同作用：如成纤维细胞和巨噬细胞从抑制生长状态被肿瘤细胞驯化为促瘤状态（如TAMs分泌大量的蛋白酶、细胞因子和生长因子促进肿瘤生长）；MDSCs和Treg扰乱DCs抗原递呈，抑制T细胞和B细胞增殖活化和NK细胞的毒杀作用，干扰肿瘤微环境的免疫平衡；另外，静息状态下，多数肿瘤细胞在蛋白水平不表达或低表达PD-L1，仅当效应性T细胞浸润至肿瘤组织、释放IFN-γ并作用于肿瘤细胞后，才通过一系列的分子信号途径诱导PD-L1表达上调，进而介导获得性免疫耐受的发生。因此，肿瘤微环境中，对免疫治疗产生显著影响的核心要素是：1.特异性杀伤T细胞的浸润丰度；2.依赖于IFN-γ通路的PD-L1表达情况，以及各种活化性分子的下调表达、抑制性分子上调表达；3.各种抑制性T细胞的活化及清除。陈列平教授团队2012年即提出，联合检测肿瘤浸润性淋巴细胞（Tumor Infiltrating Lymphocyte，TIL）及肿瘤微环境中的PD-L1，能够优化对PD-1单抗的疗效预测。基于这两个指标，可以将肿瘤患者初步分为四个亚型：Type I：获得性免疫耐受型（TIL+, PD-L1+）；Type II：免疫无反应型（TIL-, PD-L1-）；Type III：原发诱导表达型（TIL-, PD-L1+）；Type IV：其他通道逃逸型（TIL+, PD-L1-）。尽管该分型实现了免疫细胞及分子层面的进一步细化，但仍然存在诸多短板：第一，针对TIL细胞的分类不足，而不同类型的TIL浸润对预后指导意义大不相同；第二，针对TIL的计数评分常采用主观的二级半定量评分，可重复性不高，不同中心、不同病理师的阅片判读结果不容易达成一致；第三，常规方法难以满足肿瘤微环境分析的要求，如：蛋白印记和流式细胞学的方法丢失了肿瘤的形态信息；分子水平的检测（一代、二代测序、qPCR）能够分辨出足够多的基因型或细胞型组分，但无法判断这些组分在组织原位的空间位置关系，而这种定位关系对理解其在微环境中的作用又是至关重要的；常规免疫组化方法无法分辨足够多的细胞表型。所以，目前迫切需要开发出针对肿瘤微环境的多标记景观分析系统，可对微环境免疫细胞进行定位、定量、定性，并能满足精准免疫治疗所必需的标准、可重复的体系要求。

2、原发耐药的机制探索。免疫治疗原发耐药包含肿瘤细胞本身固有因素以及肿瘤细胞外部因素。固有因素包括：异常基因突变频率及总突变负荷；肿瘤抗原表达的缺失；原癌基因活化（EGFR、KRAS、MAPK，PI3K、WNT等）导致PD-L1的固有表达；肿瘤本身缺乏有效的抗原呈递系统；肿瘤本身缺乏主要组织相容性复合体（MHC）的表达；IFN-γ信号途径的异常突变导致肿瘤对杀伤性T细胞的不敏感等（见图1）。而外部因素包括：肿瘤微环境中缺乏杀伤性T细胞浸润； CTLA-4和其他免疫检查点的异常活化；T细胞衰竭和表型变化；免疫抑制性细胞群（Treg，MDSC，II型巨噬细胞）以及肿瘤微环境中细胞因子和代谢产物释放（CSF-1，色氨酸代谢物 ，TGF-β，腺苷）对免疫微环境产生的抑制效应（见图2）。

图1 肿瘤细胞对PD-1/PD-L1单抗治疗原发耐药及继发耐药的机制（引用自Padmanee Sharma，CELL，2017）

图 2 肿瘤细胞对PD-1/PD-L1单抗治疗耐药的外部因素（引用自Padmanee Sharma，CELL，2017）

对于上述复杂过程，如何发现、干预并深入挖掘其机制，是现阶段巨大的挑战。尽管如此，对肿瘤、血液及其他样品采取基线和动态分析模式，可以帮助我们为现阶段及今后的深入研究作好准备。肿瘤微环境的基线评估通常包含对血液或组织样本的总突变负荷、驱动基因突变情况以及多基因表达的综合分析，也包括对CD8+T细胞的PD-L1、TCR表达情况及克隆能力的分析。而在治疗前后（治疗前、治疗早期和进展时间点）对新鲜连续人类标本（肿瘤，血液，血清和微生物组）进行纵向动态评价，则有可能通过深度分析揭示治疗抗性的潜在机制（见图3）。这种基线和动态的分析方法超越了对静态时间点的常规分析，并能通过动态评估癌症应答寻找优异的预测性生物标志物。因此，它将成为临床及转化基础研究中，深入揭示免疫检查点抑制剂反应及耐药机制的重要手段。

图3基线及动态监测血液、组织等样本有助于深入挖掘免疫治疗耐药的机制（引用自Padmanee Sharma，CELL，2017）