科创中国

▼

基因编辑技术作为一种颠覆性新技术，现已广泛应用于作物的遗传改良，显示出巨大的发展潜力和应用价值。但是编辑效率仍然是基因编辑技术的一个限制性因素，优化Cas9蛋白，设计多个sgRNA同时靶向一个基因，优化sgRNA发夹结构等都可以提高CRISPR-Cas9在植物体内的编辑效率。一般来说在设计sgRNA时，通常选择20 bp的碱基，减少sgRNA的长度，基因编辑的效率会提高，同时也会增加脱靶活性。增加sgRNA的长度对基因编辑效率的影响目前在植物中报道较少。

近日，中国农业科学院生物技术研究所农业农村部农业转基因生物安全评价(分子)重点实验室在The Crop Journal在线发表了题为“Effects of sgRNA length and number on gene editing efficiency and predicted mutations generated in rice”文章，通过设计不同长度和不同数量的sgRNA，构建植物表达载体转化到水稻，在水稻中证明sgRNA长度与编辑效率呈正态分布，20 nt sgRNA的编辑效率最高，同时观察到CRISPR-Cas9系统在植物体内具有编辑偏好性，主要为单碱基A或T插入。

论文系统分析了sgRNA长度 (17、18 、19、20、21、22和23 nt) 和数量（1个或2个）对编辑效率的影响。体外试验结果表明，反应5分钟时，只有sgRNA长度为18, 19和20 nt 的反应体系中100%的目标DNA被Cas9蛋白在靶位点切割；反应30分钟时，其他长度sgRNA反应体系中目标DNA的切割效率在50.49%~82.3%（图1）。随后研究者构建了对应的植物表达载体，并通过农杆菌介导法导入水稻中花11中，共获得了1283棵转基因植株，其中371株编辑成功。通过对编辑效率和编辑类型统计分析，发现sgRNA的长度和编辑效率大体呈现正态分布，20 nt的sgRNA编辑效率最高，增加或者缺失碱基都会降低编辑效率，双sgRNA的编辑效率远高于单个sgRNA；在单个sgRNA编辑成功的植株中，大多数编辑位点是在PAM序列第三个碱基处插入单核苷酸A或T，且大部分为杂合突变；在双sgRNA中，最常见的编辑类型是大片段缺失，其次是单核苷酸T的插入，且大部分为双等位突变（图2）。该文章通过对不同长度的sgRNA进行评估，证实了20 nt的sgRNA具有最高的编辑效率，提供了一个sgRNA可编辑的长度范围；基于编辑的这种偏好性，我们可以在研究基因功能的同时，设计精确的单核苷酸插入和删除基因序列，从而选择合适的sgRNA，最终得到期望的突变体和良好的作物性状。

图1 不同长度的sgRNA介导的Cas9体外断开DNA的效率

图2 不同长度和数量的sgRNA在水稻中的编辑效率及Cas9介导的突变偏好性分析

作者和基金项目

2018级博士生刘肖静为该文的第一作者，王志兴研究员和王旭静研究员为共同通信作者。该研究得到中央级公益性科研院所基本科研业务费专项的资助。中国农业科学院生物技术研究所/农业农村部农业转基因生物安全评价(分子)重点实验室主要聚焦生物技术产品安全评价研究。该团队已在Plant Journal等国内外学术期刊上发表多篇论文。

THE CROP JOURNAL

The Crop Journal英文宣传片，敬请收看！

The Crop Journal (《作物学报（英文版）》)是中国科协主管，中国作物学会、中国农业科学院作物科学研究所和中国科技出版传媒股份有限公司共同主办的学术期刊，创刊于2013年10月。办刊宗旨为刊载作物科学相关领域最新成果，开展国际学术交流，促进我国作物科学研究水平及国际影响力的提升。主要刊登农作物遗传育种、耕作栽培、生理生化、生态、种质资源以及与农作物有关的生物技术、生物数学、农业气象等领域以第一手资料撰写的研究论文、研究简报以及专题综述等。2020年The Crop Journal的SCI影响因子为4.407，在JCR农学和植物学两个学科位于Q1区，并位列中科院分区农林类期刊一区。2019–2023年获中国科技期刊卓越行动计划重点项目资助。

↓【点击下方“阅读原文”查看PDF】 

中国作物学会(The Crop Science Society of China)成立于1961年，是我国作物科技工作者和单位自愿结成、依法成立的学术性、全国性、非营利性社会组织，中国科学技术协会主管的全国学会，依托单位为中国农业科学院作物科学研究所。业务范围包括国际合作、学术交流、书刊编辑、专业展览、科学普及、技术推广、成果鉴定、科技奖励、标准制订、业务培训、咨询服务。经过60年的风雨沧桑，今天的中国作物学会拥有6个工作委员会、21个专业委员会和30个省、自治区、直辖市作物学会，是联系我国作物科技工作者的桥梁和纽带。主办期刊《作物学报》、THE CROP JOURNAL和《作物杂志》；作为第二主办单位，联合主办《麦类作物学报》。

扫码关注我们

关注“中国作物学会”或“作物之窗”微信公众号，点击“加入我们/会员注册”，即可注册个人会员。